A origem das sinapses em animais descerebrados

As unidades morfofuncionais básicas que possibilitam os comportamentos exibidos pelos animais são as sinapses, as junções entre células excitáveis especializadas como neurônios e músculos, através dais quais a comunicação eletroquímica ocorre e por meio da qual são controlados os processos sensório-efetores e de integração que subjazem aos modos de vida mais ativos típicos desses seres, nós incluídos. As sinapses podem ser vistas, como explica Kenneth Kosik do Instituto de Pesquisa em Neurociência no Departamento de Biologia Molecular, Celular e do Desenvolvimento (NRI/MCDB) da Universidade da Califórnia, em Santa Bárbara, como microprocessadores que realizam muitas funções sofisticadas, tais como enviar e receber sinais, mas também mudar a forma como enviam e recebem sinais de acordo com o que ocorreu anteriormente, modificando suas característica em função de sua atividade, uma propriedade conhecida como "plasticidade" que está na base dos processos de aprendizagem.

Porém, compreender como estas unidades e os elementos que elas conectam surgiram ao longo da história dos seres vivos têm sido uma tarefa complicada, especialmente examinar seus primórdios que infelizmente não deixam fósseis. Por causa disso, temos que nos voltar para o grupo de animais vivo que se separou dos demais antes que os sistemas nervosos mais primitivos evoluíssem no ancestral comum que compartilhamos com cnidários, estrelas do mar, vermes, insetos e os demais vertebrados. Por isso, a melhor forma de investigarmos como os animais 'cerebrados' começaram a evoluir é estudando nossos parentes descerebrados, as esponjas.

O sequenciamento prévio de um representante desse grupo (Porifera), a esponja Amphimedon queenslandica, que habita a grande barreira de cora, na Austrália, já havia revelado as primeiras pistas. Em seu genoma puderam ser identificados genes muito semelhantes (prováveis homólogos) aos que nos demais animais levam a formação das sinapses.

A questão interessante é que mesmo as esponjas possuindo basicamente os genes necessários para construírem as sinapses, estes animais não o fazem já que nem ao menos neurônios elas têm, como afirma Cecilia Conaco - na época, no NRI/MCDB, da Universidade da Califórnia Santa Bárbara (UCSB) -, co-autora de um trabalho que foi publicado no mês passado no periódico científico PNAS, intitulado  “Functionalization of a protosynaptic gene expression network.” e que teve como co-autores Danielle Bassett, do Departamento de Física e do Centro Sage para estudos da mente, Hongjun Zhou e Mary Luz Arcila, ambos o NRI/MCDB da UCSB, Sandie M. Degnan,  Bernard M. Degnan, da Universidade de Queensland, na Austrália, além do autor sênior, o já mencionado Kosik co-diretor do instituto.

Hoje me dia, não existem dúvidas de que boa parte da inovação evolutiva envolve principalmente processos de mutação (seguidos de deriva e seleção natural) em genes pré-existentes, especialmente a duplicação gênica e aquelas mutações que alteram os elementos regulatórios e que produzem novos sítios de interação das proteínas sintetizadas a partir desses genes. Estes processos podem explicar, em grande parte, como a partir de um estoque ancestral de genes conservados novas estruturas e funções podem emergir durante a evolução, como parece ser o caso do complexo sináptico. Ainda assim, as várias etapas evolutivas envolvidas na organização e refinamento dessas redes de interações, que fazem com que surjam uma unidade funcional biológica discreta, permanecem obscuras e demandam métodos precisos e muita criatividade, além de muito trabalho duro de investigação.

Novos estados de ativação celular e novos tecidos são formados por meio da modificação dos padrões de ativação dos genes e da quantidade de seus produtos, isto é, através de alterações no tipo e quantidade de diferentes proteínas e RNAs. Esses diferentes produtos em diferentes quantidades e' formam redes de interação distintas e que possibilitam que cada tipo celular exista, resultando em padrões de adesão, movimento, proliferação e migração diferentes. Por causa disso, os padrões de co-expressão dos genes são importantes para definirmos funções e estruturas específicas e podem indicar, quando estamos analisando genes candidatos a  ortólogos (aqueles genes cuja origem se deu por herança direta a partir de um ancestral comum e são basicamente o mesmo gene em organismos diferentes), a conservação de função e do papel do gene em questão na formação de uma dada estrutura compartilhada.

Por isso, com o intuito de compreender mais a fundo como se deu a transição evolutiva entre organismos sem neurônios e sinapses para os animais com estes tipos celulares e as estruturas funcionais que os conectam, os pesquisadores empregaram procedimentos de análise de rede de modo a identificarem padrões únicos de co-expressão de genes 'sinápticos' em espécies representativas que localizam-se em diferentes posições na árvore filogenética dos animais.

Ao lado estão, em A, os genes homólogos aos do complexo sináptico humano que foram identificados nos genomas dos organismos selecionados que representam eventos de separação das linhagens e, neste sentido, 'passos filogenéticos chave' (como referem-se a eles os autores do estudo) na evolução animal. As cores indicam o ancestral inferido no qual cada gene deve ter se originado, como indicado em B, que, por sua vez, traz as relações evolutivas entre os filos animais. [Os nomes das espécies representantes são mostrados.]

Como a construção de uma sinapse neuronal depende da coordenação precisa da síntese de várias proteínas, os pesquisadores envolvidos no estudo, rastrearam os padrões de expressão dos genes que codificam um conjunto essencial de proteínas altamente conservadas entre os diversos grupos animais e que são empregadas no processo de sinaptogẽnese, comparando seus padrões de expressão em uma amostra representativa do grupo dos metazoários. Os padrões de codependência e corregulação dessas proteínas foram avaliadas através de medidas correlacionais dos padrões de expressão dos vários transcritos dos genes investigados, o que mostrou que os padrões de correlação aumentam significativamente com a emergência de sistemas nervosos funcionais.

Os perfis de expressão dos genes homólogos aos envolvidos na formação das sinapses em outros animais foram obtidos por sequenciamento dos transcritos de quatro fases de desenvolvimento - da larva à forma adulta - da A. Queenslandica. Essas amostras foram comparadas com os perfis de expressão dos genes equivalentes de cinco outras espécies animais que exibem uma variada complexidade na organização tecidual e que já apresentam sinapses, incluindo uma espécie de coral Acropora millepora (Cnidaria); invertebrados bilatérios, como Caenorhabditis elegans (nematoda) e Drosophila melanogaster (Arthropoda); além de dois vertebrados, o peixe-zebra, Danio rerio (Actinopterygii) e o anfíbio, Xenopus tropicalis (Sarcopterygii/Tetrapoda).

O primeiro resultado que atrai a nossa atenção  é que as esponjas - que possuem praticamente um conjunto completo desses genes, aos quais os cientistas referem-se como “protosinápticos” por que esses animais não possuem sinapses - exibem padrões muito menos correlacionados de expressão do que os dos animais com sistemas nervosos e que formam sinapses, apesar de alguns módulos de genes co-expressos poderam ser identificados ao empregarem-se procedimentos de análises de redes.

Na figura abaixo e a direita podem ser vistas os resultados das análises de correlação e modularidade para redes de expressão gênica de seis organismos. Em (A) (a Fig 3 do artigo) estão mostradas a força de corregulação genética para quaisquer dois genes em uma rede, que foi estimada pelo cálculo do coeficiente de correlação de Pearson da sua expressão através dos vários estádios de desenvolvimento. Os 'mapas de calor' representam matrizes N × N com as correlações de genes de cada rede para cada espécie (vermelho: correlação positiva e azul: correlação negativa).

Em B, D, F e H estão as correlações médias, R, calculadas a partir dos dados das matrizes em A. Já em C, E, G e I podem ser vistas as estimativas da corregulação de diferentes módulos que foram estimadas pelo valor-Q. Os cálculos para cada rede verdadeira (círculos vermelhos) também foram realizadas em conjuntos de dados controle: permutados no tempo (1.000 versões aleatoreamente misturadas a partir da matriz de correlação, losangos laranjas), conjunto aleatórios de genes (100 conjuntos de genes de tamanho N, aleatoreamente alocados a partir de todo o transcriptoma: triângulos azuis), e matrizes de número aleatórios (100 matrizes geradas com o mesmo número de genes e estágios de desenvolvimento que a verdadeira rede: quadrados verdes). O número de genes incluídos na análise para cada rede em cada espécie está indicado entre parênteses. As barras de erro representam Desvios Padrão (SD) de R e Q, ressaltando que alguns SDs são menores do que o tamanho do marcador. Os asteriscos indicam uma diferença significativa em relação ao conjunto de genes aleatório usados como controle (P <0,05, bicaudal teste t).

Os processo de detecção dessas comunidades de genes corregulados é um processo dirigido pelos dados e portanto não é enviesado a priori pelo conhecimento prévio que temos sobre as funções dos genes envolvidos na análise. A composição dos módulos (representados pelas cores dos nós) de três dos maiores complexos funcionais (densidade pós-sináptica, vesícula sináptica, e vATPases) pode ser vista na figura abaixo (Fig. 4B do artigo) e podemos perceber que genes correspondentes a densidade pós-sináptica tendem a cair dentro de um único módulo na maioria dos eumetazoa. Esta mesma tendência também foi encontrada nos genes das vesículas sinápticas na maioria dos bilateria. Em contraste, como esses mesmos genes nas esponjas cujos módulos funcionais mostraram-se um padrão de expressão bem mais heterogêneo, como se seguissem uma lógica regulatória distinta daquela das redes sinápticas funcionais, como pode ser apreciado pela maior diversidade na composição dos módulos dentro de cada complexo biológico.

Os autores chamam nossa atenção para uma exceção notável, entretanto. O complexo da ATPase vacuolar (vATPase) mostra-se bem corregulado mesmo na esponja, o que sugere que mesmo antes do desenvolvimento das sinapses e das células nervosas (portanto, antes das esponjas terem divergido dos outros grupos animais) ele já deveria ter uma função bem definida.

Nas imagens acima e abaixo a direita é possível vermos os módulos corregulados cujos genes das redes sinápticas de cada espécie que os compõem foram alocados por meio da otimização de modularidade. Os genes foram coloridos de acordo com o módulo do qual foram derivados, com o tamanho do módulo sendo indicado como segue: azul > vermelho > amarelo > verde.  Em cinza estão os genes não representados no organismo ou sobre os quais não haviam dados de expressão disponíveis [Apenas genes com os dados de expressão disponíveis em cada uma das espécies é que foram incluídos na análise.]. Os círculos de linhas tracejadas representam os limites aproximados das três redes sinápticas: densidade pós-sináptica, vesícula sináptica, e vATPases. Em (B) estão as percentagem de genes em cada complexo funcional que pertencem aos módulos corregulados detectados pela técnica de otimização de modularidade. As cores correspondem aos módulos de genes em A. Os asteriscos indicam complexos para os quais 50% ou mais dos genes pertencem ao mesmo módulo corregulado.

É interessante observar que, assim como as redes de expressão de genes [proto]sinápticos, as redes de genes 'epiteliais' também não possuem correlatos morfológicos óbvios, tendo o tecido epitelial e posteriormente neuronal evoluído após a separação dos eumetazoários das esponjas. De maneira semelhante ao encontrado na análise do conjunto de genes nas redes sinápticas, os padrões de expressão gênicos epiteliais das seis espécies - como evidenciados pelos cálculos de correlação média, R, e modularidade, Q, das rede correguladas (Fig. 3 D e E) - revelaram que todas as espécies testadas apresentaram 'Rs' significativamente maiores quando comparados par a par com as esponjas (valor-P < 1 × 10^-8, teste t bicaudal )

Como esperado, esses achados sugerem que as sinapses funcionais evoluíram ao 'exaptarem' a maquinaria celular pré-existente, provavelmente através de algum tipo de modificação dos circuitos reguladores desses genes, como os seus elementos promotores e reforçadores cis-regulatórios. Alguns do módulos de genes co-expressos que puderam ser identificados funcionando nos tecidos das esponjas continuam a funcionar perfeitamente dentro das sinapses dos animais modernos, sugerindo sua antiguidade.

Por fim, os cientistas testaram uma outra ideia, a de que os genes envolvidos em sistemas bioquímicos e celulares já presentes em todos os eucariontes mostrariam um padrão diferente de expressão, talvez mais característico do maquinário que havia adquirido suas funções antes da origem dos animais. Os mesmos procedimentos de otimização de modularidade foram executados a partir dos dados dos transcriptomas dos genes homólogos do complexo do poro nuclear (NPC) e do proteassoma 26S.

As redes desses sistemas mais antigos são altamente interligadas e exibem um grau de distribuição negativamente desviada, muito diferentes dos 'hubs' relativamente grandes e com distribuições positivamente desviadas que são observados, por exemplo, nas redes sinápticas e epiteliais de mamíferos. A presença da carioteca, o envoltório nuclear, é uma das características distintivas dos eucariontes e assim também é o sistema NPC, um de seus principais componentes, responsável pelo transporte de moléculas entre o núcleo e o citoplasma, constituído por cerca de 30 genes que codificam proteínas conhecidas como nucleoporinas.

Ao analisarem as redes correguladas dos genes nucleoporinas, a partir dos seus transcritos, os cientistas observaram uma maior correlação média, R, e menor modularidade, Q. Estas últimas geralmente inferiores as das redes sinápticas ou epiteliais, quando comparadas com as das mesmas espécies. Os resultados foram bastante consistentes, com maioria das redes do NPC mostrando Rs maiores e Qs menores ao serem comparados com conjuntos de dados alterados por permutação ou aleatórios de tamanhos iguais, sugerindo aos pesquisadores que os componentes do NPC agem de maneira bem coesa como uma única unidade funcional. Esse resultado é bastante diferente do exibido pelas redes sináptica e epitelial, com a maior modularidade dessas redes indicando, talvez, a maior necessidade de subdivisão organizacional para que as sinapses funcionem bem, quem sabe, como resultado de terem sido montadas durante a evolução a partir de outras redes menores e mais antigas, os submódulos, como o do complexo da ATPase vacuolar que tinham e tem ainda outras funções, portanto, sua organização geral sendo limitadas por certos fatores coercitivos, como demandas múltiplas.

O proteassoma 26S é um complexo multimacromolecular que tem como função a degradação de proteínas, sendo muito bem conservado e composto dos produtos da transcrição de mais de 31 genes diferentes. A análise dos módulos corregulados formados por estes genes homólogos revelaram um padrão similar ao do NPC, exibindo maior correlação média e menor modularidade em comparação com as redes sinápticas ou epiteliais dentro de cada espécie.

Todos os eumetazoa apresentaram correlação significativamente maior quando comparados par a par com as esponjas (valor-p < 1 × 10^-52, teste t bicaudal). A corregulação e a modularidade dos genes proteassômicos diferiram significativamente dos dados de permutação no tempo ou aleatória, menos nas esponjas, mas em compensação, em todas as espécies testadas, o que inclui a esponja, o conjunto de genes do proteassoma também apareceu como uma comunidade distinta quando analisados em conjunto com genes do NPC, provavelmente, representando um módulo funcionalmente significante.

Ao lado são mostrados os resultados da técnica de otimização de modularidade que detecta comunidades de genes biologicamente relevantes. Nela podemos observar os 'mapas de calor' representando matrizes N × N de correlações de Pearson para redes gênicas unitárias do NPC e do proteassoma. As correlações positivas são mostradas em vermelho e as negativas em azul.

A medida utilizada foi a média de similaridades de partição que foi calculada a partir de testes de permutação com 1.000 iterações. Essa medida mostrou que ao serem comparados com o conjunto de genes misturados aleatoreamente, os genes nas redes unitárias agrupam-se em comunidades que mais bem recapitulam a partição real entre redes (P <0,05 ). As barras de coloridas à direita dos mapas de calor indicam os limites das comunidades de genes corregulados detectados (Módulos) e a localização relativa dos genes do NPC (laranja) e do proteassoma (azul) dentro das comunidades detectados (Genes).

Esses resultados assemelham-se muito aos obtidos para um eucarionte unicelular como a levedura Saccharomyces cerevisiae, em que as redes de genes do NPC e do Proteassoma exibem alta interconectividade, mas baixa modularidade, com valores médios bem similares aos dos metazoários. Isso mostra que as redes que evoluíram há muito tempo estabelecendo suas funções antes da origem dos animais, tendem a se mostrarem muito mais interconectadas (como mostrado pelo alto grau de correlação), mas ao mesmo tempo menos modularizadas, o que é bem consistente com o padrão de conectividade entre os produtos gênico sendo bem mais homogêneo.

A análise dessas redes, portanto, mostra como a evolução de estruturas como o epitélio e sinapses ocorreu por meio do recrutamento de genes pré-existentes e mesmo de conjuntos menores de genes corregulados representando complexos funcionais que passaram a ser incorporados em módulos maiores, o que resultou em diferenças da organização da estrutura das redes, em nítido contraste com  a organização das redes responsáveis por estruturas e sistemas biomoleculares mais antigos que são mais homogêneas em termos de seu padrão de conexão.

Os autores enfatizam a importância da aplicação das técnicas de análises de redes ao dados genômicos emergentes e de expressão gênica, especialmente por que eles podem nos trazer insights sobre a evolução dos complexo maquinário bioquímicos e celulares por trás de estruturas tão impressionantes como as sinapses.

O crescimento da complexidade dos organismos ao longo de evolução têm dependido das redes de interação de genes e seus produtos. Este fato torna-se mais claro quando percebemos que o número de genes não aumentou muito ao longo da evolução dos animais e, portanto, a expansão das redes de interação de genes e dos seus produtos - RNAs e proteínas - fundamentais para os processos de organogênese, morfogênese e amadurecimento dos tecidos, teve como base as propriedades de interação e comunicação celular, efetivando-se através da combinação dos genes já existentes e da corregulação dos seus padrões de expressão e interação.

Neste contexto, várias estudos têm afirmado que as redes de expressão gênica seriam livres de escala e, embora não existam evidências conclusivas, muitas delas apresentam uma cauda em sua distribuição que, segundo os autores, indicaria a presença de grandes 'hubs'. Um modelo de crescimento de redes livres de escala sugere que as expansão se dê continuamente pela adição de novos 'nós' e que esses novos 'nós' interagiriam preferencialmente com os sítios que já estivessem bem conectados, o que faz sentido frente aos vários achados do trabalho.

Mais uma vez, o tema do uso do que já existe, modificando-o e empregando em combinações diferentes, se sobressai, mostrando como a evolução biológica pode ser rastreada e reconstruída se levarmos a sério esse princípio simples.

____________________________________

Referências:

• Srivastava M, Simakov O, Chapman J, Fahey B, Gauthier ME, Mitros T, Richards GS, Conaco C, Dacre M, Hellsten U, Larroux C, Putnam NH, Stanke M, Adamska M, Darling A, Degnan SM, Oakley TH, Plachetzki DC, Zhai Y, Adamski M, Calcino A, Cummins SF, Goodstein DM, Harris C, Jackson DJ, Leys SP, Shu S, Woodcroft BJ, Vervoort M, Kosik KS, Manning G, Degnan BM, Rokhsar DS. The Amphimedon queenslandica genome and the evolution of animal complexity. Nature. 2010 Aug 5;466(7307):720-6. PubMed PMID: 20686567; doi:10.1038/nature09201

• Conaco C, Bassett DS, Zhou H, Arcila ML, Degnan SM, Degnan BM, Kosik KS. Functionalization of a protosynaptic gene expression network. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Jun 26;109 Suppl 1:10612-8. Epub 2012 Jun 20. doi: 10.1073/pnas.1201890109

• Fernandez, Sonia Clues to nervous system evolution found in nerve-less sponge  [18-Jun-2012] University of California - Santa Barbara via Eurekalert.org
  

Créditos das Figuras:

http://spongebob.wikia.com/wiki/File:SpongeBob%27sBrainHouse.jpg

Exemplar adulto de Amphimedon queenslandica [ Fonte: Adamska M, Degnan SM, Green KM, Adamski M, Craigie A, et al. (2007) Wnt and TGF-β Expression in the Sponge Amphimedon queenslandica and the Origin of Metazoan Embryonic Patterning. PLoS ONE 2(10): e1031. doi:10.1371/journal.pone.0001031 [Link] ]

JOHN BAVOSI/SCIENCE PHOTO LIBRARY

JOHN BAVOSI/SCIENCE PHOTO LIBRARY